PROTEÍNAS I (ensayos de reconocimiento de proteínas)

Vamos a identificar si en cada sustancia hay presencia de proteínas, a través de ensayos con Biuret y Xantoproteico.

Objetivos y materiales

Extraer la caseína de la leche y reconocer su naturaleza proteica.

-Vaso de bohemia

-Varilla de vidrio

-Mechero

-Soporte

-Tela metálica

-Gradilla

-Tubos de ensayo

-Termómetro

-Papel de filtro

-Leche descremada

-Ácido etanoico 2,0M

-Hidróxido de sodio al 10%

-Sulfato cúprico al 1%

-Ácido nítrico concentrado

Fundamentos de la técnica

Con cada ensayo pretendemos identificar proteínas, el criterio que vamos a utilizar para determinar si es negativo o positivo, en Biuret, si el ensayo queda de color violeta intenso es positivo, en el Xantoproteico si cambia su color a amarillo oscuro quiere decir que es positivo.

PROTEÍNAS

Las proteínas son compuestas de carbono, oxigeno hidrogeno y nitrógeno. La mayoría de ellas contienen además azufre, y algunos fósforos. Sus moléculas son de proporciones coloidales, todas son muy complejas molecularmente y tienen alto peso molecular. La molécula proteica está compuesta de una combinación de aminoácidos por condensación. Las pro teosas, peptonas, péptidos y aminoácidos son derivados de las proteínas formados en síntesis e hidrólisis.

REACCIÓN DE BIURET

La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret.

Debido a dicha reacción fue que observamos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre mas solución de proteína precipito una coloración violeta. Quedando en el fondo del tubo una tonalidad azul cielo reacción positiva.
Precipitando a una coloración amarilla la reacción nos torna negativa al no haber presencia de proteínas.

Identificación de proteínas mediante la reacción el Biuret

La reacción debe su nombre al Biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción. La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos presentando un máximo de absorción a 540 nm. Da positiva esta reacción en todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.




Reacción xantoproteica

La reacción xantoproteica es un método que se puede utilizar para determinar la presencia de proteínas solubles en una solución, empleando ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali, se torna color amarillo oscuro.
La reacción xantoproteica se puede considerar como una sustitución electrofílica aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el ácido nítrico dando un compuesto coloreado amarillo a pH ácido.

Descripción de los ensayos efectuados con cada muestra e interpretación de los resultados obtenidos:

1) La leche es:
a) Una emulsión de materia grasa (principalmente triacilglicéridos) en un medio acuoso.
b) una suspensión de materia proteica (caseína, albumina, globulina) en un medio acuoso.
c) una solución acuosa de sales minerales y lactosa.
Contiene además menores de lecitina, vitaminas, enzimas, nuclétidos, y gases disueltos.
La composición es variable según la especie considerada.

Dentro de los componentes proteicos encontramos:
1) Caseína: complejo de proteínas fosforadas. Constituye el 80% del total de los compuestos nitrogenados.
2) Proteínas de lactosuero: albuminas y globulinas. Se insolubilizan por acción del calor antes de los 100 ºC
3) Proteosas- peptonas: Glicoproteínas poco abundantes en la leche.

CASEÍNA:

Es una proteína de carácter ácido debido a su elevada proporción de aminoácidos ácidos (PI=4,6).
La caseína humana es más rica en cistina y glúcidos que la vaca lo que la hace más apropiada para el bebé.
Reacciona con las bases formando caseinatos utilizados en la industria para la fabricación de colas y adhesivos. También se utiliza en la industria textil.
La caseína precipita por acción de los ácidos. Esto puede ocurrir a través de las formulaciones de ácido láctico por la acción bacteriana sobre la lactosa o mediante el agregado de un ácido hasta alcanzar el pH correspondiente a su punto isoeléctrico. La precipitación puede producirse por la acción enzimática de la quimiotripsina.

Fundamento de los ensayos de caracterización:

Los ensayos de Biuret y Xantoproteico permiten determinar el carácter proteico de la caseína. Así, mientras e ensayo de Biuretpone de manifiesto la presencia de enlaces peptídicos, el xantoproteico indica la presencia de restos aromáticos, en particular el grupo fenólico de la tirosina.

PROCEDIMIENTO

Primera parte: Extracción

1) Coloque aproximadamente 25 ml de leche descremada en un vaso de Bohemia
2) Caliente hasta aproximadamente 40ºC agitando con la varilla de vidrio.
3) Adicione ácido etanoico 2,0M (gota a gota) agitando en forma continua hasta coagulación total.
4) Separe el coágulo de caseína del suero mediante floración.

5) Seque cuidadosamente la caseína con la ayuda del papel de filtro.

6) Separe dos porciones del solido obtenido de aproximadamente 1 cm3 y colóquelas en dos tubos de ensayo.

Segunda parte: Caracterización

a) Reacción de Biuret: Agregue sobre la caseína uno de los tubos 20 gotas de NaOH al 10%. Luego agregue dos gotas de solución de CuSO4 al 1%.

b) Reacción Xantoproteica: Agregue sobre la caseína del segundo tubo 10 gotas de HNO3 concentrado. Espere un par de minutos y anote sus observaciones.




Observaciones:

En el lado derecho podemos observar la muestra luego del ensayo con Biuret, se ve de un color violeta, lo cual quiere decir que hay al menos 2 enlaces peptídicos. Y a la izquierda se ve la muestra con el ensayo de xantoproteico, se puede ver que queda de un color más amarillo, en lo que se puede deducir que hay presencia de tirosina o triptófano en la caseína.

GELATINA

La gelatina es una mezcla coloide (es decir, una sustancia semisólida), incolora, translúcida, quebradiza e insípida, que se obtiene a partir del colágeno procedente del tejido conectivo de animales hervidos con agua. También existe una gelatina vegetal conocida como agar-agar.

La gelatina es una proteína compleja, es decir, un polímero compuesto por aminoácidos. Como sucede con los polisacáridos, el grado de polimerización, la naturaleza de los monómeros y la secuencia en la cadena proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de las disoluciones de esta molécula es su comportamiento frente a temperaturas diferentes: son líquidas en agua caliente y se solidifican en agua fría. Al ser proteína en estado puro, ésa es su mayor propiedad nutritiva: proteína (84-90%), sales minerales (1-2%) y agua (el resto). La gelatina se utiliza en la fabricación de alimentos para el enriquecimiento proteínico, para la reducción de hidratos de carbono y como sustancia portadora de vitaminas.

Al ser proteína en estado puro, ésa es su mayor propiedad nutritiva: proteína (84-90%), sales minerales (1-2%) y agua (el resto). La gelatina se utiliza en la fabricación de alimentos para el enriquecimiento proteínico, para la reducción de hidratos de carbono y como sustancia portadora de vitaminas.

El colágeno es un componente abundante en piel, tendones, sistema vascular y otros materiales de desecho, de donde se puede obtener la gelatina comercial, que es un producto de degradación parcial del colágeno, extraída por calentamiento tras un tratamiento en medio ácido o alcalino. Dependiendo del tipo de tratamiento, se obtiene un tipo de gelatina distinto. La gelatina es un material muy útil en tecnología de los alimentos, para la obtención de geles reversibles térmicamente, de punto de "fusión" muy bajo. Estos geles se forman por enfriamiento mediante la unión de cadenas por reconstrucción parcial de hélices del tipo de las del colágeno, pero con grandes zonas desorganizadas.



Desde el punto de vista nutricional, el colágeno y aún más la gelatina, son proteínas muy desequilibradas en cuanto a su composición de aminoácidos. El colágeno es muy deficiente en triptófano, y la gelatina prácticamente carece de él, ya que el poco que existía se suele destruir en su preparación. La facilidad con la que se proteoliza depende mucho de su estado. El colágeno nativo es bastante resistente a la proteólisis por parte de la mayoría de las proteínas, mientras que el colágeno desnaturalizado se hidroliza fácilmente.

PROCEDIMIENTO

1) Preparar gelatina

2) Colocarla en dos tubos de ensayo

3) Realizar las reacciones ya mencionadas

Observaciones:

En el lado izquierdo se puede ver el resultado de gelatina con el ensayo de Biuret, es un color violeta, por lo tanto hay presencia de enlace peptídico, pero del otro lado se ve la reacción con el ensayo xantoproteico, y se observa que es incoloro, lo cual indica que es negativa la presencia de tirosina o triptófano.

OVOALBUMINA

Las proteínas de la clara de huevo entran dentro de la definición de glicoproteínas, que son proteínas que llevan enlazados contenidos diversos de glúcidos a la cadena de aminoácidos. Entre éstas, la más abundante es la ovoalbúmina, que es una fosfoglicoproteína. La ovoalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo y la que le da sus propiedades características (junto con la otra albúmina no fosforada).La ovoalbúmina es, pues, una fosfoglicoproteína de 385 restos de aminoácido con un peso molecular aproximado de unos 42.7 KDa. Es una proteína de referencia en bioquímica y es conocida a la industria alimentaria por sus propiedades como transportadora, estabilizadora y formadora de emulsiones. Se desnaturaliza por calor a los 78ºC (temperatura de semidesnaturalización) perdiendo su estructura replegada de albúmina y produciendo un gel con gran retención de agua.

PROCEDIMIENTO

1) Romper un huevo

2) Separar la clara de la yema

3) Remover la clara y colocarla en agua

4) Colocar parte de la solución en dos tubos de ensayo

5) Realizar las dos reacciones mencionadas

Observaciones:

Se puede ver a la izquierda el resultado de la solución de ovoalbúmina con el ensayo de Biuret, se puede observar que su color cambia a violeta, lo cual indica que hay enlaces peptídicos, y a la derecha se ve el resultado de la solución con el ensayo de xantoproteico, se observa un color más blanco amarillento, lo cual quiere decir que existe tirosina o triptófano en la ovoalbúmina.

ASPARTAMO:

El aspartamo es un edulcorante no calórico, es estable cuando se encuentra seco o congelado, pero se descompone y pierde su poder edulcorante con el transcurso del tiempo, cuando se conserva en líquidos a temperaturas superiores a 30 °C. La dulzura relativa del aspartamo es de 150 a 200 veces más dulce que el azúcar. Es necesario destacar que todos los edulcorantes se clasifican con respecto a la sacarosa o azúcar común, por lo que el valor de 200 veces es obtenido en comparación con diluciones hechas en laboratorio de sacarosa.

En la estructura de este edulcorante podemos observar que hay grupo amina, un ácido carboxílico, un éster, un anillo bencénico y un grupo amida unido por un enlace peptídico que se formó por la pérdida de una molécula de agua.

PROCEDIMIENTO

1) Tomar una punta de espátula de edulcorante y colocarla en dos tubos de ensayo.

2) Agregar un poco de agua en cada uno de los tubos.

3) Realizar las reacciones mencionadas anteriormente.

Observaciones: Después de realizar los ensayos de Biuret y xantoproteico, se observa a la derecha solución con Biuret da como resultado un color azul clarito, por ende, es negativo, por lo tanto no hay enlaces peptídicos, y a la izquierda, vemos una solución incolora, como resultado del aspartamo con el ensayo de xantoproteico, por lo tanto es negativo, el aspartamo no presenta tirosina o triptófano

GLICINA

La glicina además de ser un aminoácido neutro, participa en la neurotransmisión donde tiene una función inhibitoria. Se forma a partir de la serina, otro aminoácido que a su vez se forma desde el ácido pirúvico, o lo que sería lo mismo, desde la glucosa en la etapa anterior al ciclo de Krebs. El precursor inmediato de la glicina es la serina, que se convierte en glicina por la actividad de la enzima serina hidroximetiltransferasa (SHMT).

La glicina es uno de los aminoácidos que forman las proteínas de los seres vivos. Es el aminoácido más pequeño y el único no quiral de los 20 aminoácidos presentes en la célula. Su fórmula química es NH2CH2COOH y su masa es 75,07. La glicina es un aminoácido no esencial.

PROCEDIMIENTO

1) Colocar una punta de espatula en un tubo de ensayo

2) Agregar un poco de agua

3) Realizar las reacciones mencionadas previamente

Observaciones: Al igual que el aspartamo, da negativo con ambos ensayos, por lo tanto, no tiene ni enlaces peptídicos, ni resenta tirosina o triptófano.

Proteínas del suero de la leche

La proteína del suero de leche es una colección de proteínas globulares que pueden ser aisladas físicamente del suero de la leche, subproducto procedente de productos lácteos como el queso, a su vez fabricados de la leche de vaca, oveja, cabra o búfala. Desde el punto de vista químico es una mezcla de proteínas como la beta-lactoglobulina (~65%), la alfa-lactoalbumina (~25%), y la seroalbúmina (~8%), todas ellas solubles en agua en sus formas nativas independientemente del pH de la solución. El suero de leche posee el mayor valor biológico (VB) de cualquiera proteína conocida, es decir que se transforma en un alto porcentaje en proteína muscular durante las actividades metabólicas. Hoy en día se comercializa esta proteína en un polvo soluble de bajo coste procedente de los restos de la industria del queso. Suele comercializarse como suplemento para musculación.

La fracción de proteína en el suero de la leche es aproximadamente un 10% del peso y comprende cuatro principales tipos de proteínas. El mayor contenido es de beta-lactoglobulina, alfa-lactoalbumina, seroalbúmina e inmunoglobulina. Cada uno de estos componentes posee importantes efectos beneficiosos contra la lucha de algunas enfermedades.

Procedimiento:
1) Con el suero que quedó luego de la primera parte con la leche descremada, lo filtramos con papel de filtro.

2)Luego de ser filtrado, le colocamos una base para crear un medio má básico.

3) Le colocamos los ensayos de Biuret y xantopoteico ya mencionados.

OBSERVACIÓN
Con ambos ensayos químicos el resultado fue positivo, por lo tanto el preparado hay presencia de enlaces peptídicos, y tirosina o triptófano.

DIÁLISIS

En bioquímica, la diálisis es el proceso de separar las moléculas en una solución por la diferencia en sus índices de difusión opresión osmótica a través de una membrana semipermeable.La diálisis es una técnica común de laboratorio, y funciona con el mismo principio que diálisis médica. Típicamente una solución de varios tipos de moléculas es puesta en un bolso emipesrmeable de diálisis, como por ejemplo, en una membrana de la celulosa con poros, y el bolso es sellado. El bolso de diálisis sellado se coloca en un envase con una solución diferente, o agua pura. Las moléculas lo suficientemente pequeñas como para pasar a través de los poros (a menudo agua, sales y otras moléculas pequeñas) tienden a moverse hacia adentro o hacia afuera del bolso de diálisis en la dirección de la concentración más baja. Moléculas más grandes (a menudo proteínas, ADN, o polisacáridos) que tiene dimensiones significativamente mayores que el diámetro del poro son retenidas dentro del bolso de diálisis. Una razón común de usar esta técnica puede ser para quitar la sal de una solución de la proteína. La técnica no distinguirá efectivamente entre proteínas.

Para está parte vamos a utilizar los ensayos con Biuret para determinar si hay presencia de proteínas y nitrato de plata (AgNO3) para determinar la presencia de  cloruro de sodio

PROCEDIMIENTO
1)Colocamos agua destilada en un cristalizador.

2)Dentro colocamos un recipiente sin base con una membrana semipermeable.

3)El preparado (solución de ovoalbúmina-proteína (cationes Na+) y sal-cloruro de sodio (aniones Cl- va a ir dentro del recipiente con base de membrana semipermeable.

En el cristalizador van a pasar las moléculas de menor tamaño, capaces de atravesar la membrana y dentro del recipiente sin base van a quedar las proteínas(necesarias en este caso) o moléculas de mayor tamaño.

4)Sacar dos muestras de lo que quedó dentro del cristalizador y lo que quedó dentro del recipiente.

5)A una de la muestra del cristalizador le colocamos AgNO3, y a la otra el ensayo de Biuret

6)Lo mismo hacemos con las muestras que sacamos de adentro del recipiente.

Con AgNO3 y Biuret (Interior)

OBSERVACIONES

En ambos da positivo, ya que con AgNO3, da un precipitado de color blanco y con Biuret da un precipitado color violeta, por lo tanto hay presencia de proteínas, y también cloruro de sodio.

Con AgNO3 y Biuret (Exterior)

OBSERVACIONES:

Con AgNO3, da un precipitado color blanco, por lo tanto es positivo, entonces hay presencia de cloruro de sodio. Con el ensayo de Biuret, queda un precipitado color celeste claro, por lo tanto es negativo, no hay proteínas, lo cual se explica ya que las proteínas no pasaron por la membrana semipermiable, el cloruro de sodio si, ya que es una molécula más pequeña.

Camila Demarco

Anthony Fernández